Sau khi thắng trận Chancellorsville tại Virginia vào tháng 05 năm 1863, tướng Lee đã kéo quân qua thung lũng Shenandoah và bắt đầu cuộc xâm lấn miền bắc lần thứ nhì - chiến dịch Gettysburg. Nhân lúc tinh thần quân đội lên cao mạnh mẽ, Lee dự định chuyển trọng tâm cuộc chiến mùa hè ra khỏi vùng Bắc Virginia đang bị chiến tranh tàn phá, và hy vọng sẽ đánh chiếm được Harrisburg, Pennsylvania hoặc thậm chí là Philadelphia để gây sức ép buộc giới chính trị gia miền Bắc nhượng bộ và ngưng chiến. Tổng thống Hoa Kỳ Abraham Lincoln khi đầu cử tướng Joseph Hooker ra đánh, nhưng chỉ ba ngày trước trận đánh ông đã cho tướng Meade lên thay thế.

Hai đoàn quân bất ngờ[26] đụng độ ngày 1 tháng 7 năm 1863 tại Gettysburg, khi Lee đang gấp rút tập trung lực lượng của mình tại đó với ý định tấn công và bức hàng Binh đoàn Potomac của thiếu tướng George Meade.[27] Dải đất khá thấp ở phía tây-bắc thị trấn ban đầu do một sư đoàn kỵ binh miền Bắc của chuẩn tướng John Buford trấn giữ, ngay sau đó có thêm hai quân đoàn bộ binh tiếp trợ nhưng vẫn không chống được hai quân đoàn lớn của miền Nam ồ ạt tiến công từ hai phía bắc và tây-bắc. Phòng tuyến xây đắp vội vàng của miền Bắc bị phá tan, quân phòng thủ phải bỏ chạy theo các lộ chính của thị trấn kéo về các ngọn đồi phía nam.

Sang ngày thứ nhì, phần lớn quân đội hai bên đều đã tập hợp đầy đủ. Quân Liên bang miền Bắc lập đội hình phòng thủ như hình lưỡi câu. Chiều ngày 2 tháng 7, tướng Lee cho quân Liên minh miền Nam kéo đến đánh mạnh vào sườn bên trái của trận đồ này. Hai bên đánh nhau dữ dội tại 4 chiến địa Wheatfield, Little Round Top, Devil's Den và Peach Orchard. Ở sườn bên phải, các đòn tấn công nghi binh đã leo thang trở thành một cuộc tấn công toàn diện tại hai cứ điểm đồi Culp và đồi Cemetery. Trên khắp chiến trường, quân miền Nam cố đánh tràn sang nhưng quân miền Bắc - dù bị thiệt hại nặng nề - đánh bại được các đợt tiến công của địch. Đến tối, đoàn quân của Meade đã tập kết và vẫn hoàn toàn giữ vững được các cứ điểm quan trọng.[10][15]

Ngày thứ ba, 3 tháng 7, hai bên tiếp tục đánh nhau tại đồi Culp, và những cuộc chiến của kỵ binh cũng nổ ra ở phía đông và phía nam, nhưng sự kiện chính của ngày hôm đó là cuộc tấn công của Pickett, khi 12.500 quân bộ binh miền Nam tiến hành công kích vào phòng tuyến trung tâm đội hình quân miền Bắc tại Cemetery Ridge. Cuộc tấn công bị quân miền Bắc dùng súng trường và đại bác đánh tan tành, gây tổn thất vô cùng nặng nề. Một chút lính của Pickett tiến sâu vào phòng tuyến quân miền Bắc đã bị đập tan[15]. Các binh sĩ miền Bắc khi đánh bại quân miền Nam đã tràn ngập tư tưởng rửa hận cho đại bại trong trận Fredericksburg hồi cuối năm 1862.[28] Đợt công kích lớn cuối cùng của cuộc Nội chiến đã bị tan tác.[10] Thua lớn rồi, lại sợ quân miền Bắc phản kích, Lee phải thu quân.[10][15] Với một đội quân tả tơi và gần hết đạn, ông không còn cách nào khác phải rút về Virginia. Quân Lee chịu thêm tổn thất nặng nề nữa trong cuộc triệt binh ô nhục này.[3] Tuy nhiên, Meade không thể phát huy lợi thế để mà triệt tiêu quân của Lee, dù ban đầu Lincoln ca ngợi đại thắng này như một niềm vinh quang của Binh đoàn Potomac.[16][19] Điều này khiến Tổng chỉ huy Henry W. Halleck chỉ trích ông, cho dầu ai nấy đều tôn vinh người chiến thắng của trận Gettysburg - một thắng lợi huy hoàng.[17][29] Qua nhiều thập kỷ, các nhà sử học đã tìm lời lý giải cho thất bại to lớn của Tướng Lee.[13]

Thất bại tại Gettysburg của miền Nam là một bước ngoặt lớn của chiến tranh nói riêng và của cả lịch sử Hoa Kỳ nói chung[30]: việc Lee tập trung binh lực cho mặt trận phía Đông đã khiến mặt trận phía Tây bị bỏ lửng và đó là cơ hội tốt cho quân miền Bắc dưới sự chỉ huy của U. S. Grant tấn công và hạ gục Vicksburg sau nhiều tháng bao vây. Lee không chỉ thất bại trong chiến dịch tấn công miền Bắc mà còn để mất tuyến liên lạc quan trọng dọc theo sông Missisipi; kể từ đó miền Nam bị cắt rời làm hai nửa và quân miền Bắc có một bàn đạp quan trọng trong việc tiến vào hậu phương của miền Nam. Chiến bại ở trận Gettysburg cũng phá vỡ huyền thoại về sự bách chiến bách thắng của Lee, trong khi Vicksburg thất thủ đúng một ngày sau khi Liên bang đại thắng tại Gettysburg.[16][31] Không những Thiếu tướng Meade mà các chiến sĩ dưới quyền ông cũng thể hiện sức chiến đấu mãnh liệt trong trận thắng quan trọng này.[13] Điều đó kết hợp với lợi thế về địa hình của phe Liên bang và sự hiếu thắng của Lee đã dẫn tới đại thắng ấy.[19] Các binh sĩ Liên bang giờ đây hừng hực khí thế, vì họ đã tin chắc rằng họ có thể đánh thắng được viên tướng giỏi nhất của Liên minh.[17] Thực chất, thảm họa này thể hiện Tướng Lee ở thời điểm tệ hại nhất của ông và tiêu hủy cái huyền thoại về đoàn binh bách thắng của ông.[3][21]

Chỉ trong 3 ngày tử thần[31], thương vong của cả hai bên đã lên cao[9] đến mức khoảng 46.000 đến 51.000 người. Trong Nội chiến Hoa Kỳ, nếu trận Antietam là trận đánh có số tử vong trong một ngày cao nhất (khoảng 23 nghìn lính bị chết hay bị thương) thì trận Gettysburg cũng không kém, với khoảng 2 vạn binh lính tử trận hay bị thương trong vài giờ chiều ngày thứ nhì của trận đánh. Người ta ước lượng trong 3 chiến địa Wheatfield, Little Round Top, và Devil's Den, cứ mỗi giây đồng hồ là có hơn một người bị chết hay bị thương. Sư đoàn của Pickett là Sư đoàn miền Nam duy nhất chịu thương vong trên 50%, nhưng về Lữ đoàn thì cả hai phe đều có những Lữ đoàn tổn thất lên đến tầm cỡ ấy.[7] Quân miền Bắc chiến thắng dẫu chịu tổn thất cao, nhưng tổn hại của quân miền Nam còn thảm khốc và cao hơn, và thậm chí có người còn xem trận Gettysburg là một thắng lợi quyết định của miền Bắc (ít ra cũng là một bước ngoặt quyết định hơn chiến thắng Antietam trước đó).[3][26] Quân miền Nam thua to lại kém nhân lực hơn nêu không thể bù đắp cho thiệt hại to lớn của mình, và nạn đào ngũ bùng phát cực lớn sau đại bại.[7][20] Dẫu Lincoln thất vọng vì quân miền Nam đã triệt binh về an toàn, hai đại thắng của quân miền Bắc tại trận Gettysburg và Vicksburg - một thắng lợi bước ngoặt xoay chuyển thế trận hướng Đông và một thắng lợi quyết định cả hướng Tây[9] - đã làm tiêu tan hoàn toàn hy vọng về một thắng lợi của quân miền Nam, khiến cho người miền Nam sẽ phải lùi dần về thủ đô Richmond[9], mà ít ra miền Nam cũng cảm thấy phe miền Bắc trên đà thắng lợi không thể lùi bước nếu so đo nhân lực, cho tới khi miền Bắc toàn thắng vào năm 1865.[15][31][32] Bản thân Lincoln cũng nhìn nhận sự cống hiến vĩ đại của Meade, trong khi Lee coi mình có trách nhiệm với thảm họa này.[11][19]

Không những là trận chiến lớn nhất trên đất Mỹ,[10] trận đánh Gettysburg trở thành một trong những trận chiến tiêu biểu nhất của thế kỷ thứ XIX.[33] Kỳ diệu thay, quân Liên bang đại thắng tại trận Gettysburg ngay trước ngày Độc lập (4 tháng 7), góp phần lớn cho ngày hôm đó được coi là ngày Độc lập huy hoàng nhất của Mỹ Quốc hồi ấy.[18][34] Trong khi tháng 7 năm 1863 trở thành mốc quan trọng của cuộc chiến[35], vào tháng 11 năm 1863, Abraham Lincoln đã đọc bài diễn văn Gettysburg lịch sử trong buổi lễ khánh thành Nghĩa trang Quốc gia Gettysburg để khẳng định lại mục đích của chiến tranh, hứa hẹn ngày thống nhất qua chiến thắng Gettysburg vẻ vang[36] và tưởng niệm những chiến sĩ đã ngã xuống trong trận đánh kinh hoàng nhất của cuộc Nội chiến.